超分辨率三種顯微技術(shù)的研究

熒光顯微鏡和熒光顯微技術(shù)：熒光顯微鏡是免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的基本工具。它是由光源、濾板系統(tǒng)和光學(xué)系統(tǒng)等主要部件組成。是利用一定波長(zhǎng)的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光，通過(guò)物鏡和目鏡系統(tǒng)放大以觀察標(biāo)本的熒光圖像。熒光顯微技術(shù)是應(yīng)用短波光照射被測(cè)物質(zhì)以激發(fā)其發(fā)射熒光從而在熒光顯微鏡下觀察。
2、單分子熒光成像

當(dāng)顯微鏡需要分辨兩個(gè)或者更多點(diǎn)光源的時(shí)候，很難突破光學(xué)分辨率的極限來(lái)進(jìn)行精確定位。而當(dāng)顯微鏡的物鏡視野下僅有單個(gè)熒光分子的時(shí)候，通過(guò)特定的算法擬合，此熒光分子位置的精度可以很容易超過(guò)光學(xué)分辨率的極限，達(dá)到納米級(jí)。在同樣的信噪比圖像上，用高斯函數(shù)擬合單分子熒光的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)可以達(dá)到最佳的定位精度．Thompson 等科學(xué)家結(jié)合了理論推導(dǎo)和計(jì)算機(jī)模擬，綜合考慮了各種因素的影響，如離散時(shí)間段檢測(cè)到的發(fā)出光子數(shù)的泊松噪聲、CCD 相機(jī)的背景讀出噪聲以及CCD 像素點(diǎn)的大小等，得到了單分子在二維定位精度上的近似公式： 其中x 為定位的誤差，s 為點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)方差，a為CCD 像素的大小，N 為收集到的光子數(shù)，b 為背景噪聲。

PALM和STORM：盡管單分子的定位精度可以達(dá)到納米級(jí)，但它并不能提高光學(xué)顯微鏡在分辨兩個(gè)或者多個(gè)點(diǎn)光源時(shí)的分辨率。2006年9月，Betzig和Lippincott-Schwartz 等在Science 上提出了光激活定位顯微技術(shù)：是用PA-GFP 來(lái)標(biāo)記蛋白質(zhì)，通過(guò)調(diào)節(jié)405 nm 激光器的能量，低能量照射細(xì)胞表面，一次僅激活出視野下稀疏分布的幾個(gè)熒光分子，然后用488 nm 激光照射，通過(guò)高斯擬合來(lái)精確定位這些熒光單分子．在確定這些分子的位置后，再長(zhǎng)時(shí)間使用488 nm激光照射來(lái)漂白這些已經(jīng)定位正確的熒光分子，使它們不能夠被下一輪的激光再激活出來(lái)．之后，分別用405 nm 和488 nm激光來(lái)激活和漂白其他的熒光分子，進(jìn)入下一次循環(huán)．這個(gè)循環(huán)持續(xù)上百次后，我們將得到細(xì)胞內(nèi)所有熒光分子的精確定位．將這些分子的圖像合成到一張圖上，最后得到了一種比傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡至少高10 倍以上分辨率的顯微技術(shù)，如圖所示，PALM 顯微鏡的分辨率僅僅受限于單分子成像的定位精度，理論上來(lái)說(shuō)可以達(dá)到1 nm 的數(shù)量級(jí)。 PALM 的成像方法只能用來(lái)觀察外源表達(dá)的蛋白質(zhì)，而對(duì)于分辨細(xì)胞內(nèi)源蛋白質(zhì)的定位無(wú)能為力．2006 年底，美國(guó)霍華德- 休斯研究所的華裔科學(xué)家莊曉薇實(shí)驗(yàn)組開(kāi)發(fā)出來(lái)一種類(lèi)似于PALM的方法，可以用來(lái)研究細(xì)胞內(nèi)源蛋白的超分辨率定位：隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微技術(shù)：將Cy3和Cy5分子對(duì)膠聯(lián)到特異的蛋白質(zhì)抗體上，就可以用抗體來(lái)標(biāo)記細(xì)胞的內(nèi)源蛋白．應(yīng)用特定波長(zhǎng)的激光來(lái)激活探針，然后應(yīng)用另一個(gè)波長(zhǎng)激光來(lái)觀察、精確定位以及漂白熒光分子，此過(guò)程循環(huán)上百次后就可以得到最后的內(nèi)源蛋白的高分辨率影像。
3、STED（受激發(fā)射損耗顯微技術(shù)）

用一束激發(fā)光使熒光物質(zhì)(既可以是化學(xué)合成的染料也可以是熒光蛋白)發(fā)光的同時(shí)，用另外的高能量脈沖激光器發(fā)射一束緊挨著的、環(huán)型的、波長(zhǎng)較長(zhǎng)的激光將第一束光斑中大部分的熒光物質(zhì)通過(guò)受激發(fā)射損耗過(guò)程猝滅，從而減少熒光光點(diǎn)的衍射面積，顯著地提高了顯微鏡的分辨率． STED成像技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)是可以快速地觀察活細(xì)胞內(nèi)實(shí)時(shí)變化的過(guò)程，因此在生命科學(xué)中應(yīng)用更加廣泛。

將多重相互衍射的光束照射到樣本上，然后從收集到的發(fā)射光模式中提取高分辨率的信息。

掃描隧道顯微鏡弱點(diǎn)

(1).對(duì)觀察樣品限制較多，例如樣品必須是導(dǎo)體，不能是非導(dǎo)體和溶液等。

(2).對(duì)樣品環(huán)境有嚴(yán)格要求，如要求高真空等。 

(3).對(duì)觀察的對(duì)象都過(guò)多過(guò)少造成損害，而光學(xué)顯微鏡對(duì)樣品的限制極少，可以是非導(dǎo)體或液體，可以是有生命的也可以實(shí)物生命的，可以是透明的也可以是不透明甚至發(fā)光的，不僅可以觀察處于靜態(tài)的樣品還可以觀察動(dòng)態(tài)情況下的樣品。至于樣品環(huán)境更無(wú)特殊要求，可以使常溫大氣壓，也可以是非常溫和非常壓的環(huán)境，觀察對(duì)物體不造成損傷則更是光學(xué)顯微鏡的一大優(yōu)點(diǎn)。
5、掃描隧道顯微鏡的工作原理

掃描隧道顯微鏡就是根據(jù)量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)與原理，通過(guò)探測(cè)固體表面原子中的電子的隧道電流來(lái)分辨表面形貌的顯微裝置。根據(jù)量子理論，由于電子的隧道效應(yīng)，金屬中的電子并不完全局限于金屬表面之內(nèi)，電子云密度并不是在表面邊界處突變?yōu)榱?。在金屬表面以外，電子云密度呈指?shù)衰減，衰減長(zhǎng)度約為1nm。用一個(gè)極細(xì)的、只有原子線(xiàn)度的金屬針尖作為探針，將它與被研究物質(zhì)（樣品）的表面作為兩個(gè)電極，當(dāng)樣品表面與針尖非?？拷ň嚯x（1nm）時(shí)，兩者的電子云略有重疊，若在兩極間加上電壓Vb，在電場(chǎng)作用下電子就會(huì)穿過(guò)兩個(gè)電極之間的勢(shì)壘，通過(guò)電子云的狹窄通道流動(dòng)，從一極流向另一極，形成隧道電流I。隧道電流I的大小與針尖和樣品間的距離S以及樣品表面平均勢(shì)壘的高度有關(guān)。關(guān)系式為：

 I∝Vbexp(-Aφ^(1/2) S)

類(lèi)似于隱失波在界面上的衰減，高分辨率正是因?yàn)檫@種指數(shù)衰減對(duì)距離的敏感性。由此可見(jiàn)，隧道電流I對(duì)針尖與樣品表面之間的距離S極為敏感，如果S減小0.1nm，隧道電流就會(huì)增加一個(gè)數(shù)量級(jí)，當(dāng)針尖在樣品表面上方掃描時(shí)，即使其表面只有原子尺度的起伏，也將通過(guò)其隧道電流顯示出來(lái)。借助于電子儀器和計(jì)算機(jī)，在頻幕上即顯示出樣品的表面形貌。